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有没有做分子的大佬，求助
我最近在做用来同源重组的质粒，到载体和片段连接的部分死活连不上。
插入片段有3个，一开始试着直接连连不上，所以用overlap PCR连成2 kb的一整个片段再和载体连。
载体线性化试了双酶切和反向PCR，6 kb左右(片段分别设计了重叠区域)。
连接方法是takara的infusion和ligation mix，反应完转化感受态，恢复培养后直接涂板。
抗生素浓度从低到高都试了，每次都是新制的板子。
感受态是DH5a，自己制备的(效率没问题)和商品化的也都试过了。是化学转化 。
转化后的板子要么是完全不长菌落，要么是空载…孩子真的要黔驴技穷了，求大佬们救救孩子(⁠´⁠；⁠ω⁠；⁠｀⁠)